Biotechnologia.pl
łączymy wszystkie strony biobiznesu
Tajniki i zastosowanie metody Flow-FISH
Tajniki i zastosowanie metody Flow-FISH
Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) jest popularną metodą, służącą do wykrywania i lokalizowania specyficznych sekwencji kwasu nukleinowego w komórkach. Dzięki połączeniu tej techniki z cytometrią przepływową można umożliwić wykrywanie docelowych sekwencji w tysiącach pojedynczych komórek. Nowa metoda, czyli flow-FISH, pozwala na poddanie każdej badanej komórki indywidualnej analizie.

 

 

Cytometria jest metodą pomiaru właściwości fizycznych oraz chemicznych pojedynczych komórek lub innych cząstek biologicznych (np. izolowanych jąder komórkowych, kwasów nukleinowych, mitochondriów lub chloroplastów), przepływających przez aparat w strumieniu cieczy. Pierwsze urządzenia, przypominające dzisiejsze cytometry, powstały w latach 40. XX w., co pozwoliło na analizę zawieszonych w powietrzu komórek bakteryjnych.

Zasada działania cytometrów przepływowych oparta jest na liniowym przepływie badanych komórek, możliwym dzięki obecności płynu osłaniającego, którego prędkość przepływu jest szybsza niż prędkość strumienia zawiesiny zawierającej badane komórki. Każda obecna w próbce komórka pojedynczo oświetlana jest cienką wiązką światła laserowego, która z kolei ulega rozproszeniu i odbiciu pod kątem zależnym od budowy badanej komórki. Do analizy wykorzystujemy dwa rodzaje detektorów. Pierwszy z nich ustawiony jest naprzeciwko wiązki światła padającej na komórkę i zbiera światło, które zostało ugięte na brzegach komórki (ang. forward scatter channel, FSC) – kąt padania wiązki zależny jest od wielkośći komórki. Drugi detektor umieszczony jest prostopadle względem wiązki światła (ang. side scatter channel, SSC), co umożliwia uzyskanie informacji o strukturze wewnętrznej komórek, a zwłaszcza o ich ziarnistości.

Ponadto cytometr przepływowy pozwala również na uzyskanie dodatkowych informacji na temat próbki – dzięki zastosowaniu odpowiednich znaczników fluorescencyjnych, możliwe jest przeprowadzenie odczytu fluorescencji. Do powszechnie stosowanych znaczników można zaliczyć znaczniki emitujące sygnał po przyłączeniu się do: białek, np. izotiocyjanian fluoresceiny (ang. fluorescein isothiocyanate, FITC), kwasów nukleinowych, np. jodek propidyny (ang. propidium iodiode, PI) i tłuszczy, np. Czerwień Nilu (ang. Nile Red).


Kilka słów o technice FISH

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ, czyli FISH (ang. fluorescent in situ hybridization), z powodzeniem łączy metody klasycznej cytogenetyki z technikami biologii molekularnej. Technika ta oparta jest na hybrydyzacji kwasów nukleinowych, przebiegającej na szkiełku mikroskopowym, czyli in situ (w miejscu). Przy użyciu sond DNA możemy wykryć specyficzną sekwencję kwasu nukleinowego w badanym materiale genetycznym. Pierwszym i kluczowym etapem jest denaturacja DNA próbki oraz DNA sondy – po zapewnieniu odpowiednich warunków termicznych następuje połączenie się sondy z komplementarną sekwencją DNA badanych komórek. Sondy znakowane są znacznikami fluorescencyjnymi, zatem analiza próbek odbywa się przy pomocy mikroskopii fluorescencyjnej.

FISH jest jedną ze starszych metod cytogenetycznych – opracowano ją we wczesnych latach 80. XX w. Początkowo badacze wykorzystywali jako znaczniki izotopy promieniotwórcze, jednak wraz z rozwojem metody zastąpiono je w pełni bezpiecznymi barwnikami fluorescencyjnymi, które dodatkowo pozwoliły na uzyskanie wysokiej czułości i rozdzielczości obrazu. Do popularnych znaczników fluorescencyjnych, używanych do znakowania sond, należą: fluoresceina, rodamina oraz kumaryna.
Wśród sond stosowanych w technice FISH wyróżniamy:

• Sondy malujące (ang. Whole Chromosome Painting, WCP),
• Sondy alfa-satelitarne, tj. centromerowe lub telomerowe (ang. Centromeric Enumeration Probes, CEP),
• Sondy specyficzne (ang. Locus Specific Identifier, LSI).

 

Flow-FISH, czyli na co pozwala nam połączenie cytometrii przepływowej oraz FISH?

W mikrobiologii cytometria przepływowa jest niezwykle pomocna w określaniu liczebności drobnoustrojów. Niestety, o ile barwienie fluorochromami interkalującymi do DNA może dostarczyć informacji o ilości komórek mikroorganizmów w danej próbce, o tyle metoda ta nie pozwala na określenie ich przynależności taksonomicznej.

Tradycyjna metoda FISH jest natomiast niezwykle czasochłonna. Ponadto aktywność metaboliczna badanych komórek ma duży wpływ na wyniki FISH, ponieważ większość typowych sond dla komórek prokariotycznych jest komplementarna do konserwatywnego fragmentu 16S rRNA, charakterystycznych dla danego rodzaju bakterii. Liczba rybosomów jest zależna od aktywności metabolicznej komórek – komórki bakterii o niskiej aktywności metabolicznej mogą mieć niską zawartość rybosomów, co w konsekwencji prowadzi do uzyskania słabych sygnałów fluorescencji.

Naprzeciw tym problemom przychodzi zastosowanie kombinacji cytometrii przepływowej i FISH, czyli metoda flow-FISH. Technika ta została opisana po raz pierwszy przez Rufera i wsp. w 1998 r., którzy w ten właśnie sposób analizowali ludzkie limfocyty. Osiem lat później Friedrich i Lanke zastosowali ją po raz pierwszy do analizy mikroorganizmów. Od tamtego czasu metoda ta jest już skutecznie stosowana do analizy zarówno czystych kultur, jak i analizy mieszanych populacji drobnoustrojów. Flow-FISH umożliwia zautomatyzowany pomiar sygnału fluorescencji pochodzący z pojedynczej komórki. Metoda ta pozwala na identyfikację konkretnych rodzajów, a nawet gatunków bakterii. Ponadto technika łącząca cytometrię przepływową i FISH pozwala na pomiar długości telomerów w różnych podklasach komórek. Długość telomerów w komórkach zwykle skraca się z wiekiem – zbyt krótkie telomery są sygnałem do zatrzymania podziałów komórkowych, indukcji procesu starzenia i apoptozy.

 

KOMENTARZE
Newsletter