Biotechnologia.pl
łączymy wszystkie strony biobiznesu
Projektujesz startery? Uważaj na SNP!
Projektujesz startery? Uważaj na SNP!
W reakcjach PCR często korzystamy ze starterów, których sekwencje znamy z opublikowanych prac naukowych. Korzystanie ze sprawdzonych sekwencji wydaje się być uzasadnione, ponieważ zwalnia z potrzeby projektowania i walidacji starterów. W dobie masowego sekwencjonowania genomów okazuje się jednak, że sekwencje opublikowane przed laty mogą nieść ryzyko fałszywych wyników. Wszystko za sprawą dużej liczby polimorfizmów pojedynczych nukleotydów (SNP).

 

 

Polimorfizm pojedynczego nukleotydu (ang. single nucleotide polymorphism, SNP) to najczęściej występująca zmienność sekwencji DNA. Polega na zastąpieniu pojedynczego nukleotydu w sekwencji innym nukleotydem. SNP może pozostawać cichą modyfikacją (tzw. synonimiczną) lub nieść ze sobą zmianę sensu kodonu (tzw. zmiana niesynonimiczna). Warianty danej sekwencji (w przypadku organizmów eukariotycznych nazywane allelami) różnią się między członkami populacji. SNP mogą wiązać się z konkretnym fenotypem lub być przyczyną chorób.

Ogólna zasada rozpoznawania SNP w oparciu o metody PCR polega na hybrydyzacji oligonukleotydów do sekwencji komplementarnych. Wynik reakcji uzależniony jest od stopnia komplementarności, szczególnie na końcu 3’ wydłużanego startera. Jeśli parowanie nukleotydów jest zaburzone za sprawą SNP, produkt reakcji pojawia się w późniejszych cyklach bądź nie powstaje wcale.

Wiedza na temat występowania SNP jest cenna w kontekście metod diagnostycznych. Istnieje jednak druga strona medalu. W dobie masowego sekwencjonowania genomów (z uwagi na prostotę, głównie bakteryjnych) poszerza się także skala występowania SNP. Badając występowanie genów z użyciem reakcji PCR bądź qPCR należy mieć na uwadze poprawny dobór starterów. Aby uniknąć fałszywych wyników, powinny być one zaprojektowane w taki sposób, aby obejmowały rejony pozbawione SNP. Z pomocą służą coraz liczniejsze bazy danych, często gromadzące sekwencje konkretnego gatunku.

Świadomość występowania SNP każe podchodzić z ostrożnością do sekwencji starterów opublikowanych w literaturze kilka lub kilkanaście lat temu, gdy wiedza o zróżnicowaniu genomów nie była jeszcze tak duża jak dziś. Jeśli nie zweryfikujemy zmienności danego fragmentu DNA, może się okazać, że otrzymany wynik reakcji PCR będzie fałszywie negatywny ze względu na niepełną komplementarność starterów w rejonie bogatym w SNP. W literaturze spotkać można przykłady wyników, które przeczą obecności niektórych genów bakteryjnych w badanych szczepach (brak produktu PCR), podczas gdy geny te klasyfikowane są dziś jako składowa genomu rdzeniowego (ang. core genome), tj. zbioru sekwencji występujących u wszystkich przedstawicieli gatunku. Aby uniknąć w przyszłości błędów metodycznych i fałszywych wniosków, podchodźmy zatem z ostrożnością to projektowanych doświadczeń.

 

Inspiracją dla artykułu było wystąpienie Marcina Brzozowskiego (Pomorski Uniwersytet Medyczny w Szczecinie) pt. „Analiza występowania polimorfizmów pojedynczych nukleotydów (SNP) w wybranych genach kodujących czynniki wirulencji Pseudomonas aeruginosa” wygłoszone podczas konferencji BioMillenium2017. Przesłane abstrakty zostaną opublikowane w piśmie „Postępy Mikrobiologii”.

KOMENTARZE
news

<Październik 2017>

pnwtśrczptsbnd
25
26
28
Forum Druku Cyfrowego
2017-09-28 do 2017-09-28
30
1
2
3
4
Warsztaty miareczkowe
2017-10-04 do 2017-10-05
7
8
11
14
17
18
21
22
26
27
28
29
30
31
1
2
3
4
5
Newsletter