Biotechnologia.pl
łączymy wszystkie strony biobiznesu
Homogenizacja jako jeden ze sposobów dezintegracji komórek
Homogenizacja, będąca jednym ze złotych standardów laboratoryjnych, jest kluczem do pozyskania materiału biologicznego, znajdującego się we wnętrzu komórek. Istnieje kilka metod stosowanych w tym celu, jednak każda z nich prowadzi do utraty albo osłabienia spójności ściany lub błony komórkowej, powodując dezintegrację i uwolnienie poszczególnych elementów komórki.

 

 

Wyodrębnienie struktur takich jak: organella komórkowe, DNA czy białka z materiałów biologicznych stanowi nie lada wyzwanie, a już pierwsze etapy tej procedury są kluczowe dla pomyślnego przeprowadzenia dalszych eksperymentów.

Szczególną trudność stanowią komórki roślinne oraz drożdżowe, które posiadają dodatkową ochronę w postaci ściany komórkowej. Uwolnienie pożądanych składników z wnętrza komórki jest istotne w przypadku metod diagnostycznych, np. gdy zachodzi potrzeba otrzymania jak największej ilości materiału genetycznego patogenu, izolowanego z tkanek pobranych od człowieka. Pozyskanie lizatów komórkowych stanowi także jeden z głównych elementów, rutynowo stosowanych w doświadczeniach naukowych, bazujących na biologii molekularnej. Wybór metody dezintegracji komórek ma istotny wpływ na dalsze wykorzystanie wyizolowanego z komórki materiału. W przypadku białek, niekiedy krytyczną właściwością, decydującą o przydatności wyizolowanego z komórki materiału, jest zachowanie przez niego aktywności enzymatycznej.

Efektywność i wydajność procesu homogenizacji zależna jest od precyzji, wykorzystanego urządzenia, doboru odpowiednich parametrów jego działania, akcesoriów, a także ścisłej kontroli środowiska reakcji. Homogenizację materiału biologicznego przeprowadza się przy użyciu specjalnych homogenizatorów bądź innymi metodami laboratoryjnymi, niewymagającymi wykorzystania tego rodzaju sprzętu.


Homogenizatory laboratoryjne
1) Homogenizator ultradźwiękowy, zwany inaczej sonikatorem, służy do procesu dezintegracji cząstek bądź komórek zawartych w zawiesinie przy użyciu fal ultradźwiękowych (dużej mocy i małej częstotliwości 20-100 kHz). Utrata spójności komórki następuje wskutek efektu kawitacji. Zjawisko to opiera się na procesach dynamicznego wzrostu oraz zaniku pęcherzy parowo-gazowych w cieczy i wywołane jest zmianami ciśnienia przy stałej temperaturze. Siły mechaniczne – tworzące się w miejscu zderzenia pęcherzyków kawitacyjnych oraz fala uderzeniowa – generowana po ich implozji są głównymi czynnikami odpowiedzialnymi za uszkodzenie komórek. Nieodwracalne lub odwracalne uszkodzenie błony komórkowej (efekt sonoporacji) wzmacniany jest przez substancje o charakterze rodników, tworzące się w wyniku termicznego rozkładu rozpuszczalnika i cząsteczek zawartych w zderzających się pęcherzykach. Prawidłowy przebieg sonikacji zależy od parametrów ultradźwięków, kształtu komórki sonikacyjnej, właściwości oraz ilości medium poddawanego sonikacji, w tym obecności pęcherzy powierza i cząstek zawiesiny.

2) Homogenizator kulkowy jest urządzeniem stacjonarnym i coraz częściej występuje w wersji zautomatyzowanej. Dezintegracja komórek przy jego użyciu polega na wykorzystaniu materiału rozbijającego w postaci kulek, które umieszczone są w homogenizowanej zawiesinie (wyjątek stanowią tzw. „procedury suche”). Budowa i właściwości kulek rozdrabniających, umożliwiają ich użycie w homogenizacji zróżnicowanego materiału biologicznego, takiego jak: twarde tkanki zwierzęce (np. tkanka kostna, zęby), twardy materiał roślinny (np. korzeń, nasiona), miękkie tkanki zwierzęce (wątroba, serce, mózg, mięśnie gładkie), miękki materiał roślinny, mikroorganizmy, bakterie oraz ich przetrwalniki.

3) Homogenizator statorowo-rotorowy wytwarza homogenat poprzez bezpośrednie uszkodzenie błony lub ściany komórkowej, za pośrednictwem noży umiejscowionych na głowicy rotora. Ze względu na sposób obsługi urządzenia, wyróżnia się homogenizator ręczny oraz stacjonarny o większej mocy. Homogenizatory stacjonarne posiadają niezautomatyzowany lub zautomatyzowany tryb pracy. W laboratoriach homogenizatory statorowo-rotorowe (w zależności od budowy rotora i głowicy) stosowane są w pracy z miękkimi lub twardymi tkankami zwierzęcymi. Homogenizacja tego typu materiału biologicznego często wymaga dodania inhibitorów proteaz komórkowych oraz obniżenia temperatury mieszaniny reakcyjnej (0-4 st. C).

4) Homogenizator ciśnieniowy umożliwia dezintegrację komórek, poprzez poddanie ich zawiesiny wysokiemu ciśnieniu – podczas jej przemieszczania się przez ciasną szczelinę – i gwałtownemu uwolnieniu do ciśnienia atmosferycznego. Metoda ta umożliwia wysokowydajną homogenizację zawiesin komórek o objętości ok. 10-30 ml, jednak staje się technicznie trudna dla mniejszych objętości oraz zbyt czasochłonna dla większych. Ten rodzaj homogenizatora stosowany jest głównie do dezintegracji komórek bakteryjnych i drożdżowych.

 

Homogenizacja bez użycia homogenizatora laboratoryjnego
1) Trawienie enzymatyczne – dezintegracja komórek bądź tkanek z wykorzystaniem enzymu składników ściany komórkowej i otrzymaniem sfero/protoplastów. W przypadku bakterii, używa się lizozymu trawiącego bakteryjne peptydoglikany, u drożdży używana jest zymoliaza/glukanaza
(enzym trawiący glukan, będący głównym składnikiem ściany komórkowej drożdży). Otrzymane sfero/protoplasty można następnie poddać szokowi osmotycznemu bądź innej technice dezintegracyjnej/separacyjnej.

2) Liza detergentami i rozpuszczalnikami organicznymi – metoda bardzo często używana do homogenizacji komórek utrzymywanych w hodowli tkankowej oraz bakterii. Liza stosowana jest głównie do uzyskania ekstraktów białkowych, poddawanych następnie rozdziałowi elektroforetycznemu oraz reakcjom immunoblottingu (Western Blot). Przy niskim stężeniu stosowanego detergentu, pozwala zachować własności izolowanych białek. Najczęściej używane detergenty to: Triton X-100, NP-40, dodecylan sodowy, siarczan sarkozylu, deoksycholan sodowy.

3) Stres osmotyczny – nagła zmiana stężenia substancji rozpuszczonej wokół komórki, powodująca gwałtowne zmiany osmotyczne. Komórki są wrażliwe na szok osmotyczny, gdy przetrzymywane są w roztworach hipotonicznych (o ciśnieniu osmotycznym mniejszym niż w cytoplazmie). Metoda ta stosowana jest głównie do lizy erytrocytów, komórek pozbawionych ściany komórkowej (np. protoplastów bakterii) oraz drożdży.

4) Rozcieranie – polega na dezintegracji komórek poprzez ich rozcieranie (np. w moździerzu) z odpowiednimi substancjami ściernymi (np. piasek lub obojętny tlenek glinu).

5) Zamrażanie/rozmrażanie – metodę tę stosuje się podczas izolacji odpornych na denaturację białek. Opiera się ona na wzroście objętości zamarzającej w cytoplazmie wody, która – tworząc następnie kryształy lodu – powoduje uszkadzanie ściany i błony komórkowej oraz organelli komórkowych. Przy wyborze tej metody homogenizacji warto jednak zwracać uwagę na fakt, że zamarzanie powoduje częściową utratę wody hydratacyjnej białek, prowadząc do zmian ich właściwości. Ograniczeniem jest także konieczność ochrony białek przed działaniem uwolnionych, głównie z lizosomów – enzymów proteolitycznych.

 

KOMENTARZE
news

<Sierpień 2017>

pnwtśrczptsbnd
31
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
Real Time PCR
2017-08-28 do 2017-08-29
29
30
1
2
3
Newsletter