Biotechnologia.pl
łączymy wszystkie strony biobiznesu
Patogeny VBNC – nowe oblicze infekcji
Patogeny VBNC – nowe oblicze infekcji

VBNC (ang. viable but not culturable) to mikroorganizmy, których nie jesteśmy w stanie namnożyć i hodować w warunkach laboratoryjnych na klasycznych podłożach mikrobiologicznych. Zjawisko to dotyczy nie tylko gatunków środowiskowych, lecz także patogenów człowieka. I tu zaczynają się schody…

 

VBNC to grupa mikroorganizmów żywych lecz niehodowalnych, których odsetek szacuje się na 99% populacji. Nazwa ta została po raz pierwszy zastosowana w 1982 r., zaś jej zasadność potwierdzają współczesne osiągnięcia technologiczne pozwalające na detekcję materiału genetycznego mikroorganizmów bez konieczności hodowli. Do grupy organizmów VBNC zaliczano głównie organizmy środowiskowe, na przykład te izolowane z wody lub gleby, których nie jesteśmy w stanie hodować w warunkach laboratoryjnych ze względu na ich specyficzne wymagania wzrostowe. Ostatnie 10 lat badań wskazuje jednak, że formy VBNC to nie tyle specyficzna cecha poszczególnych

gatunków, lecz jest to stan fizjologiczny (fenotyp), który bakteria może osiągnąć na skutek niesprzyjających warunków środowiska. Jest to stan przejściowy, z którego bakteria może powrócić do formy hodowalnej na drodze tzw. resuscytacji, w obecności czynników sprzyjających wzrostowi. Niestety zjawisko to zostało opisane także dla znanych patogenów człowieka, a czynnikiem promującym przejście w stan VBNC może być m. in. antybiotykoterapia. Fakt ten wytrąca nam z ręki podstawowe narzędzie diagnostyczne, jakim jest hodowla izolatów na specyficznych podłożach mikrobiologicznych.

 

Patogeny człowieka

Formy VBNC różnią się od form hodowalnych pod względem morfologii komórki, budowy błony i ściany komórkowej, odporności na stres chemiczny i fizyczny, a także metabolizmu, ekspresji genów czy zdolności do wirulencji. VBNC nie są jednak komórkami martwymi, co oznacza, że wciąż pozostają aktywne metabolicznie i przeprowadzają transkrypcję, jednak jest to w dużej mierze metabolizm uśpiony. Niektóre szczepy zachowują zdolność do wirulencji jako formy VBNC, co stanowi duży problem z punktu widzenia klinicznego, bowiem infekcji tego typu nie można zdiagnozować używając standardowych procedur. Opisane dotąd gatunki patogenów człowieka o udowodnionej zdolności przechodzenia w stan VBNC zebrane są w TABELI.

W większości przypadków opisano czynniki indukujące stan VBNC oraz odpowiednie warunki resuscytacji. Dla niektórych gatunków oszacowano także tzw. okno resuscytacji, czyli okres czasu, w którym komórki VBNC zachowują zdolność do resuscytacji pod wpływem danego czynnika. Jednym z lepiej opisanych patogenów VBNC jest Mycobacterium tuberculosis, dla której okno resuscytacji wynosi ok. 3,5 miesiąca. W przypadku tego gatunku stan VBNC nazywany jest też stanem latencji lub uśpienia, który dotyczy ponad 2 milionów nosicieli na całym świecie. Skuteczne leczenie tego typu infekcji wymaga zatem długotrwałej terapii.

Czynnikami promującymi wejście bakterii w stan VBNC są niesprzyjające warunki środowiska, takie jak: niedobór składników odżywczych, fluktuacje temperatury, pH, zasolenia lub dostępności tlenu, a także promieniowanie czy działanie sub-letalnych dawek różnych związków chemicznych. Opisanym zjawiskiem istotnym z punktu widzenia klinicznego jest indukcja form VBNC pod wpływem stosowania antybiotyków, co opisano np. dla Staphylococcus aureus. Ryzyko przejścia w stan VBNC wzrasta przy nieodpowiednim stosowaniu antybiotyków niezgodnie z zaleceniami, co stanowi ogromny problem w kontekście zdrowia publicznego. Istotnym rezerwuarem form niehodowalnych jest struktura biofilmu. VBNC S.aureus i S. epidermidis izolowano z biofilmów wewnątrz cewników. Formy niehodowalne, ze względu na odmienny spowolniony metabolizm, są w naturalny sposób bardziej oporne na stosowane antybiotyki. Ich obecność stwarza zatem trudności nie tylko na etapie detekcji, lecz także terapii.

Jak badać?

Czy jesteśmy bezradni wobec diagnostyki VBNC? Nie. Niemniej, rozwój specyficznych technik detekcji wciąż jest w powijakach, bowiem mechanizmy molekularne przejścia w stan VBNC nie są jeszcze dobrze poznane, a także wydają się być szczepowo - specyficzne. W badaniach naukowych podstawową strategią jest oddzielenie puli komórek hodowalnych, dających daną liczbę kolonii na podłożu mikrobiologicznych, od niehodowalnych. Wśród tych drugich należy rozróżnić pulę VBNC od komórek martwych, czemu służy szereg dostępnych testów z użyciem barwników fluorescencyjnych, reakcji enzymatycznych z wykorzystaniem soli tetrazolowych, testu na obecność ATP czy inkorporacji znakowanych radioaktywnie aminokwasów.

W warunkach diagnostycznych (klinicznych), jako alternatywa dla testów hodowlanych, do dyspozycji są techniki oparte o detekcję kwasów nukleinowych oraz specyficznych antygenów. PCR w czasie rzeczywistym jest czułą metodą detekcji DNA w próbach biologicznych. W połączeniu z odwrotną transkrypcją (RT-PCR) może służyć jako metoda detekcji specyficznych mRNA - komórki VBNC, w odróżnieniu od martwych, wciąż są w pewnym stopniu aktywne transkrypcyjnie. Detekcja specyficznych antygenów w próbach biologicznych stanowi natomiast podstawę testów serologicznych.

Głównym hamulcem w opracowaniu odpowiednich metod wciąż są ograniczenia poznawcze. Mamy świadomość, że to co wiemy na temat patogenów VBNC to jedynie szczyt góry lodowej. Poznanie mechanizmów molekularnych rządzących powstawaniem i resuscytacją VBNC oraz charakterystyka specyficznych markerów z pewnością będą siłą napędową rozwoju technik diagnostycznych w nadchodzących latach.

Źródła

Li L, Mendis N, Trigui H, Oliver JD and Faucher SP (2014) The importance of the viable but non-culturable state in human bacterial pathogens. Front. Microbiol. 5:258. doi: 10.3389/fmicb.2014.00258

KOMENTARZE
Newsletter