Biotechnologia.pl
łączymy wszystkie strony biobiznesu
10 lat po Human Genome Project — nowa era sekwencjonowania.
Po zakończeniu Projektu Poznania Ludzkiego Genomu nikt nie spodziewał się, że raczkująca wtedy technika sekwencjonowania informacji genetycznej w krótkim czasie stanie się stosunkowo powszechna, tania i szybka. Aktualnie technologia znajduje się w rozkwicie, wykorzystuje się ją na dużą skalę, a intensywne prace owocują jej doskonaleniem.

W ciągu ostatnich dwóch dekad sekwencjonowanie genomowe zyskało pozycję analizy o kluczowym znaczeniu na wielu etapach doświadczeń naukowych w biotechnologii i medycynie. Nie ryzykuje ten, kto twierdzi, że niemal każdy badacz, który ma do czynienia z DNA ostatecznie spotka się wspomnianą wyżej techniką. Szeroki wachlarz możliwości wynikający z zastosowania powyższej metody analizy genomu stał się powszechnie dostępny również dla rodzimych naukowców. Lider polskiego rynku usług nowoczesnego sekwencjonowania- firma Genomed S.A. odpowiada na zapotrzebowanie sektora naukowego i diagnostycznego.

Oferujemy kilka platform Next Generation Sequencing (NGS) różniących się technologią sekwencjonowania, ilością i długością pojedynczych odczytów oraz całkowitą ilością zsekwencjonowanych nukleotydów. Dzięki temu możemy zaproponować naszym klientom najszerszy zakres usług optymalnie dopasowany do ich potrzeb. Oferujemy usługę NGS na maszynach MiSeq (Illumina), HiSeq (Illumina), GS Junior (Roche) i PacBio RS (Pacific Biosciences) informuje dr hab. Marek Zagulski, członek Zarządu Genomed S.A.

W miarę rozwoju technologii skrócił się czas wykonania badania, a zwiększeniu uległa ilość informacji, które w takiej analizie można uzyskać.

Sekwencjonowanie DNA wykonujemy relatywnie szybko. W zależności od ilości prób i wielkości sekwencjonowanych genomów zajmuje nam to od kilku do kilkunastu dni. Małe analizy NGS, mam na myśli te obejmujące do 6 mld zasad wynikowych lub 10 genomów bakteryjnych, genom drożdży, eksom, które jesteśmy w stanie wykonać na urządzeniu MiSeq, trwają około tygodnia ‑ 3 dni zajmuje utworzenie biblioteki, a 2 dni sekwencjonowanie.  Duże analizy, tj. pełne genomy eukariotyczne, analizy transkryptomów, etc.,  zajmują więcej czasu-zaczynając od przygotowania bardziej skomplikowanych bibliotek po samo sekwencjonowanie- do 11 dni. W ramach takich sekwencjonowań robimy też podstawową analizę otrzymanych wyników. Czasochłonna może być szczegółowa analiza bioinformatyczna robiona na zamówienie i życzenie klienta, a także opracowywanie wyników na potrzeby publikacji czy patentów. Może ona zająć znacznie więcej czasu niż samo sekwencjonowanie.tłumaczy dr Mariusz Krawczyk, kierownik pracowni sekwencjonowania genomowego Genomed S.A.

Dodatkowo, szybkość analizy idzie w parze z jakością pozyskiwanych danych. Dokładność sekwencjonowania nowej generacji wynosi około 99,9%.

Na przestrzeni czasu technika zyskiwała coraz szerszą praktyczną aplikację. Obecnie wykorzystywana jest przede wszystkim w funkcjonalnej analizie genomu oraz identyfikacji fenotypów odpowiedzialnych za rozwój chorób. Sekwencjonuje się całe genomy, eksomy, a także transkryptomy lub w przypadku ograniczonej ilości czasu i środków można analizować wcześniej wytypowane pojedyncze geny lub określone ich zestawy. Wykrywane zmiany w genomie mogą dotyczyć nie tylko samej kolejności występowania zasad w sekwencji, ich substytucji, a także tak zwanych „indeli” (delecji i insercji). Modyfikacje obejmują dodatkowo wariancje liczby kopii, utratę heterozygotyczności lub translokacje. W przypadku wariancji liczby kopii sekwencjonowanie wygrało z metodami komparatywnej hybrydyzacji genomów: CGH i array-CGH, zyskując większą rozdzielczość i informację o różnicach w liczbie kopii osobno pomiędzy dwoma haplotypami.

Wzrasta liczba wykrywanych i deponowanych w bazach polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (single nucleotide polymorphisms, SNP). Początkowo skupiano się na najczęściej występujących wariantach allelicznych w określonych populacjach, aktualnie na znaczeniu zyskują warianty rzadkie. Sugeruje się, że prawdopodobnie mają one znaczenie dla uwarunkowanych genomowo predyspozycji do zaistnienia określonych chorób lub stanowią punkt uchwytu dla leków. Uwagę skierowano na nie dzięki badaniom asocjacyjnym na skalę genomu (Genome-wide association studies, GWAS), które nie były w stanie wykazać korelacji dla większości alleli pojawiających się ze wzmożoną częstością.

Sekwencjonowanie ma także określoną pozycję w eksploracji procesu nowotworzenia. Stosuje się je z nadzieją na utworzenie lepszej klasyfikacji pacjentów i ich stanów, zaprojektowanie i zastosowanie terapii spersonalizowanej, a także przewidywanie odpowiedzi na leczenie przed jego implementacją. W badaniach tych dużą rolę odgrywa szeroko pojęta diagnostyka genetyczna, z uwzględnieniem rzadkich mutacji somatycznych o znaczeniu klinicznym. Odkrywanie nowych zmian w genomie komórek nowotworowych to wciąż aktualne zagadnienie. Często podkreśla się także perspektywę działań profilaktycznych, które będzie można podjąć po przeprowadzeniu adekwatnej analizy genomu.

Technika sekwencjonowania stanowi ostateczny etap w toku wielu przeprowadzanych doświadczeń. Warto wspomnieć tutaj o odkrywaniu wzoru metylacji i innych epigenetycznych modyfikacji DNA, które wpływają na transkrypcję. Ciekawym zagadnieniem jest również poszukiwanie sekwencji regulatorowych i badanie związanej z nimi struktury genomu metodami powiązanymi z sekwencjonowaniem takimi jak FAIRE‑Seq, DNase-Seq, STARR-Seq czy HiTS-FLIP. Ponadto, technologia znajduje zastosowanie w samej analizie transkryptomów, gdzie niezastąpiony staje się RNAseq i FRT‑seq. Współcześnie, kluczowym zadaniem jest interpretacja sekwencji i przejście od genomu do jego funkcji.

Dostępna technologia daje możliwość sekwencjonowania nawet całości DNA znajdującego się w danym środowisku bez potrzeby żmudnej izolacji od poszczególnych osobników. Analiza wyników tzw. metagenomu (czasami także metatranskrptomu) pozwala na ilościowe określenie składu gatunkowego jak i obecności poszczególnych genów w środowisku. Takie podejście umożliwia monitorowanie zjawisk zachodzących w środowisku z punktu widzenia populacji. W praktyce znajduje ono zastosowanie w kontroli procesów bioreaktorach.Wysoka czułość metody oraz kompleksowość analizy pozwala na wykrycie zarówno gatunków patogennych obecnych na liniach produkcyjnych jak i ewentualnego występowania określonych genów np. warunkujących oporność na antybiotyki.

Problematyczny w analizach pozostaje DNA o niskiej jakości- ze względu na wiek, pochodzenie materiału i sposób jego pozyskania (obecność formaldehydu lub parafiny). Trudno poddają się sekwencjonowaniu niewielkie ilości materiału genetycznego- DNA pochodzącego z surowicy lub pojedynczych komórek- szczególnie ważne w analizie krążących komórek nowotworowych. Są to jedne z wymagań stawianych nowoczesnej technologii, które w przyszłości będzie musiała spełnić.

Aktualnie prowadzony jest szereg projektów opierających się o sekwencjonowanie, wśród nich znajdują się 1000genomes Project, The Cancer Genome Atlas, Grand Opportunity Exome sequencing Project, Personal Genome Project oraz wiele innych. Genomed S.A jest liderem konsorcjum POLGENOM realizującego projekt „Polski genom referencyjny dla diagnostyki genomowej i medycyny spersonalizowanej”, współfinansowany przez Narodowe Centrum Badań i Rozwoju w ramach programu INNOTECH (lata 2013‑2015). Jako cel programu ustanowiono otrzymanie i analizę pełnych sekwencji genomowych dla ok. 120 polskich stulatków. Każdy z projektów przynosi ogromną ilość danych dotyczących zmian i indywidualnych różnic w genomach osób poddanych badaniu. Sekwencjonowanie dosięga już regionów niekodujących, których rola i znaczenie nadal nie zostały wyjaśnione. Wyzwaniem staje się nie przeprowadzenie samej analizy, lecz interpretacja uzyskanych wyników.

 

Źródła

Źródła:

  1. Genomed S.A., http://www.genomed.pl/index.php/pl/sekwencjonowanie-genomowe
  2. Lehrach H. DNA sequencing methods in human genetics and disease research. F1000Prime Rep. 2013 Sep 2;5:34.
  3. Matullo G, Di Gaetano C, Guarrera S. Next generation sequencing and rare genetic variants: from human population studies to medical genetics. Environ Mol Mutagen. 2013 Aug;54(7):518-32.
  4. Ulahannan D, Kovac MB, Mulholland PJ, Cazier JB, Tomlinson I. Technical and implementation issues in using next-generation sequencing of cancers in clinical practice. Br J Cancer. 2013 Aug 20;109(4):827-35.
  5. Xuan J, Yu Y, Qing T, Guo L, Shi L. Next-generation sequencing in the clinic: Promises and challenges. Cancer Lett. 2013 Nov 1;340(2):284-95.
KOMENTARZE
Newsletter