PGD dla chorób monogenowych

Obecnie PGD stosowane jest do około 200 różnych chorób genetycznych, dziedziczonych: autosomalnie recesywnie, autosomalnie dominująco czy sprzężonych z chromosomem X. Największa liczba PGD została wykonana pod kątem powszechnych chorób autosomalnych recesywnych: mukowiscydozy, β- talasemi, rdzeniowego zaniku mięśni; chorób autosomalnych dominujących: dystrofii mitotycznej typu I, choroby Huntingtona (HD); chorób sprzężonych z chromosomem X: zespołu łamliwego chromosomu X, dystrofii mięśniowej Duchenna, hemofilii.

Częstość stosowania diagnostyki preimplantacyjnej pod kątem innych chorób monogenowych jest niska, natomiast spectrum chorób diagnozowanych, się powiększa, w tym wzbudzające kontrowersje:

1. Choroby ujawniające się „z opóźnieniem” tzn. w wieku dojrzałym np. pląsawica Huntingtona (35-50 lat) czy rodzinna polipowatość gruczolakowa, ujawniająca się w 3-4 dekadzie życia

2. Nowotwory warunkowane genami o niskiej penetracji np. np. rak piersi warunkowany mutacją w genie BRCA1

3. Choroby nie zagrażające życiu jak głuchota dziedziczna

Obecnie coraz częściej PGD jest stosowane w celu selekcji embrionu (rodzeństwa) o zgodnych ludzkich antygenach leukocytarnych ( HLA ang. human leukocyte antigens) z chorym dzieckiem (HLA-PGD) w celu późniejszego przeszczepu szpiku kostnego lub komórek macierzystych temu dziecku. Dodatkowo odnotowano kilka zastosowań PGD do zaburzeń mitochondrialnych.

Przy opracowywaniu protokołu diagnostycznego dla określonej choroby należy uwzględnić takie czynniki jak: sposób dziedziczenia w rodzinie i rodzaj mutacji. Większość chorób monogenowych jest powodowana przez zmiany pojedynczego lub kilku nukleotydów, natomiast rzadko przez większe rearanżacje genów (przeważnie delecje). Początkowo strategie PGD koncentrowały się na detekcji tylko mutacji powodującej chorobę, ale wraz z rozwojem technik molekularnych zaczęto stosować multipleksową analizę sprzężeń polimorficznych markerów by zlokalizować wiele miejsc w obrębie rejonu genomu związanego z chorobą. W ten sposób z lub bez równoczesnej analizy mutacji powodującej chorobę diagnozowanie oparte jest o informację z kilku miejsc w genomie. Wadą metody w porównaniu z bezpośrednim genotypowaniem jest konieczność przeprowadzenia analizy genetycznej również na członkach rodziny. Analiza polimorficznych markerów jest coraz częściej stosowana wspomagająco dla diagnozy opartej jedynie na analizie mutacji ze względu na zjawisko wypadania alleli (ADO ang. allele drop out). Zjawisko to polega na losowym nie amplifikowaniu jednego z alleli podczas reakcji PCR. Heterozygotyczny embrion może być błędnie zdiagnozowany jako „zdrowy” lub „chory” w zależności od tego który allel nie będzie amplifikowany.

Ogromne spektrum wskazań chorobowych oraz różnice specyficzne rodzinnie nawet w obrębie tego samego wskazania powoduje, że jest tylko kilka protokołów mających charakter ogólny, wyjątkiem są protokoły oparte o amplifikację całego genomu - WGA (ang. whole genome amplification). WGA pozwala wyeliminować ograniczenia bezpośredniego PCR pojedynczych komórek takie jak: ADO, czy zanieczyszczenia próbki dające zafałszowane wyniki. Procedura ta zalecana jest przy małej ilości materiału do badania.

Niektóre choroby wymagają specjalnych procedur analitycznych na przykład pląsawica Huntingtona, zespół łamliwego chromosomu X, dystrofia miotoniczna. W przypadku pląsawicy Huntingtona u osób, mających świadomość swojej choroby, PGD może być przeprowadzona poprzez bezpośrednie testowanie ekspansji trójnukleotydów CAG w exonie 1 genu HTT. U osób, które są w grupie ryzyka, ale nie chcą mieć świadomości jak duże jest to ryzyko mogą być przeprowadzone dwie procedury: wykluczenia (ang. exclusion testing) lub nieujawnienia (ang. non-disclosure testing). Procedura wykluczenia bazuje na identyfikacji alleli HTT pochodzących od dziadków i implantowane są tylko te zarodki, które posiadają oba allele HTT od zdrowych dziadków. Wadą tej procedury jest konieczność testowania członków rodziny. Dodatkowo statystycznie ok. połowa odrzuconych zarodków to zarodki zdrowe. W procedurze nieujawniania zarodki analizowane są bezpośrednio pod kątem powtórzeń CAG, ale wyniki nie ujawniane są przyszłym rodzicom.

Do analizy chorób sprzężonych z chromosomem X stosuje się obecnie udoskonalone metody oparte o PCR, które umożliwiają, oprócz oceny płci, diagnozę choroby. Dotychczas połowa męskich zarodków była prawdopodobnie zdrowa, ale odrzucana.

W przypadku rodzin dotkniętych mutacjami w obrębie mitochondrialnego DNA oprócz badań prenatalnych, dawstwa oocytów, zastąpienia mtDNA możliwa jest od niedawna PGD. Jednak ze względu na skomplikowaną patobiologię chorób genetycznych spowodowanych mutacjami mtDNA PGD może mieć ograniczoną wiarygodność. Mitochondria dziedziczone są w linii matczynej i komórki posiadają ich tysiące, a każde mitochonrium posiada wiele kopii genomu mitochondrialnego. Cechą charakterystyczną chorób związanych z mutacjami mtDNA jest koegzystencja normalnego i zmutowanego mtDNA w pojedynczej komórce tzw. heteroplazmia. Pojawienie się objawów klinicznych a także różnorodność fenotypu i penetracji choroby jest zależna od takich czynników jak: efekt progowy (czy obciążenie mutacyjne przekracza określony poziom w komórce), segregacja mitotyczna, klonalna ekspansja, czy tzw. efekt wąskiego gardła. Chociaż mechanizm tego ostatniego nie jest do końca poznany, według jednej z teorii we wczesnym stadium rozwoju komórki rozrodczej następuje gwałtowna redukcja mtDNA, a następnie szybka jego ekspansja gdy komórka jajowa dojrzewa, co sprawia, że niektóre oocyty mają zredukowany poziom mutacji i mogą znajdować się poniżej wartości progowej. Rezultat PGD trofoektodermy w takim wypadku jest nieprzewidywalny. Możliwy jest natomiast pomiar stosunku zmutowanych do normalnych mtDNA w komórce embrionalnej z dużym stopniem dokładności. Badania wykazują, że jeśli obciążenie mutacyjne w takiej komórce jest niskie to szansa na ‘zdrowy’ embrion jest duża. PGD dla zaburzeń mitochondrialnych wydaje się być obiecująca, ale dalsze badania przed szerszym klinicznym zastosowaniem są konieczne.

Specjalne procedury są stosowane również w przypadku PGD-HLA. Selekcja pod kątem tylko HLA może być przeprowadzano, gdy chore dziecko wymaga transplantacji krwiotwórczych komórek macierzystych do leczenia nie dziedzicznej choroby lub równocześnie z PGD by dodatkowo wykluczyć chorobę genetyczną. Obecnie najczęstszym wskazaniem do PGD-HLA są beta-talasemia i/lub anemia sierpowata. PGD-HLA stosuje się również w przypadku niedokrwistości Fanconiego, choroby Gauchera, adrenolekukodystrofii, osteopetrozy i innych chorób monogenowych. Testowanie HLA jest dużym wyzwaniem technicznym ze względu na duży region analizowany (3.6 Mb), dużą liczbę loci, wysoki polimorfizm i możliwe rekombinacje w regionie HLA. Dopasowywanie haplotypów embrionów i chorego rodzeństwa przeprowadzane jest obecnie za pomocą analizy sprzężeń polimorficznych markerów w obrębie regionu HLA

Red. Dr inż. Małgorzat Karbarz

Oprac. Dr n. społ. Błażej Kmieciak