Do wykrywania specyficznych białek można zastosować m.in. metodę western blot, immunocytochemię czy cytometrię przepływową.

Immunocytochemia pozwala na wykrycie oraz lokalizację składników komórek i tkanek. W metodzie immunocytochemicznej stosuje się zasadę powinowactwa antygenu i przeciwciała i uwidocznienie tego zjawiska w preparatach mikroskopowych. Przeciwciało znakuje się, aby można było uwidocznić jego pozycję w komórce, a wiec także pozycję rozpoznawanego przez nie białka. Do badań o małej rozdzielczości stosuje się znakowanie fluorescencyjne oraz mikroskopię konfokalną. Immunocytochemię o dużej rozdzielczości można przeprowadzić za pomocą mikroskopii elektronowej i znaczników gęstych elektronowo, takich jak złoto koloidalne.

Metoda western blot to proces detekcji pojedynczych białek w homogenacie komórkowym lub ekstrakcie białkowym. Białka podlegają rozdziałowi z zastosowaniem elektroforezy. Następnie zostają uruchomione na specjalnej membranie i barwione przeciwciałami. Białka komórkowe muszą zostać uwolnione z komórek. Do tego celu stosuje się metody mechaniczne (np. homogenizacja) lub bufory zawierające detergenty (np. SDS) i związki chelatujące jony jak EDTA. Rozdział białek następuje po przeprowadzeniu elektroforezy np. na żelu poliakrylamidowym (zwykle w warunkach denaturujących w żelu zawierającym SDS). Białka segregowane według ich masy cząsteczkowej ulegają przeniesieniu na nitrocelulozową membranę za pomocą metody elektrotransferu wykorzystującej pole elektryczne. Tak przygotowaną membranę poddaje się barwieniu przeciwciałami. Zazwyczaj stosuje się dwa przeciwciała: przeciwciało pierwszorzędowe, wiążące się specyficznie do poszukiwanego białka oraz znakowane przeciwciało drugorzędowe, które wiąże się z przeciwciałem pierwszorzędowym. Elementem znakującym przeciwciała może być enzym, który po zastosowaniu substratu chromogennego wywołuje reakcję barwną lub katalizuje reakcje chemiluminescencyjną umożliwiając wizualizację kompleksów immunologicznych na membranie.

Cytometria przepływowa to metoda, umożliwiająca ocenę wielkości, intensywności zabarwienia i intensywności fluorescencji badanych komórek. W cytometrze przepływowym zawiesina komórek w otoczce płynu osłaniającego zostaje wprowadzona do urządzenia w postaci laminarnie płynącego strumienia. Pojedyncze komórki ulegają oświetleniu przez cienkie wiązki monochromatycznego, spolaryzowanego światła. Rejestrujące ten proces układy optoelektroniczne, wychwytują zmiany sygnału elektrycznego powodowane przez komórki rozpraszające, załamujące, odbijające i absorbujące światło. Układ optyczny zawiera źródło światła, układ kształtujący i ogniskujący wiązkę laserową w komórce. Kolejnym elementem jest układ optyki zbierającej, odfiltrowujący poszczególne długości fal oraz ogniskujący promienie świetlne na fotokaskadzie detektorów. Odpowiednio przetworzone informacje z tych detektorów pozwalają ocenić parametry strukturalne zbiorów komórek (rozmiar, kształt, ziarnistość cytoplazmy, zawartość barwników naturalnych lub dodanych w wyniku barwienia, intensywność fluorescencji).

Do pomiaru światła rozproszonego służą dwa detektory. Pierwszy rejestruje rozproszenie proporcjonalne do kierunku wiązki laserowj (FSC, ang. forward scatter channel), drugi prostopadłe do kierunku wiązki (SSC, ang. side scatter channel). Siła sygnału rejestrowanego przez FSC (zgodnego z kierunkiem wiązki) wzrasta wraz ze wzrostem rozmiaru obiektu. Siła sygnału SSC rejestrującego światło rozpraszane prostopadle zależy od kształtu obiektu i od charakterystycznych dla badanego obiektu współczynników załamania i odbicia światła. FSC charakteryzuje komórki pod względem wielkości, a SSC pod względem kształtu i ziarnistości.

Cytometria charakteryzuje się wysoką wydajnością, co umożliwia badanie znacznej liczby komórek w krótkim czasie i jednoczesną oceną wielu parametrów. W przypadku cytometrów wyposażonych w urządzenie sortowania komórek w polu elektrycznym (ang. Fluorescence Activating Cell Sorting), które odchyla płynące komórki zgodnie z różnicami potencjału elektrycznego poszczególnych komórek, możliwe jest izolowanie pojedynczych komórek wykazujących ekspresję określonych antygenów powierzchniowych. Cytometria przepływowa znajduje zastosowanie w diagnostyce klinicznej. Metoda ta używana jest w diagnostyce niedoborów odporności np. choroba AIDS poprzez analizę populacji CD4+ i CD8+. Ważną rolę cytometrii przypisuje się w ocenie immunofenotypu komórek w diagnostyce białaczek ostrych i przewlekłych, chłoniaków, zespołów mielodysplastycznych i mieloproliferacyjnych. Metoda ta umożliwia również charakterystykę komórek w celu określenia etapu cyklu komórkowego lub określenia ilości komórek martwych, poliferujących lub apoptotycznych. Cytometria przepływowa znajduje też zastosowanie w określaniu oporności wielolekowej stosowanej w chemioterapii niektórych preparatów.  

red. Blanka Majda